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Histoplasmose cerebral. 7. Técnicas especiais para fungos : Grocott + HE, Grocott + verde luz, PAS

Masc. 54 a. Clique para : página de resumo do caso com história clínica, estudos de imagem (RM 2011; RM e TC 2012), macroscopia do cérebro, HE (lesões no III ventrículo, lesão gliótica-fibrótica na comissura anterior, lesões nos ventrículos laterais, lesões no IV ventrículo e meninges da base), tricrômico de Masson, reticulina, Grocott + HE, Grocott + verde luz, PAS, imunohistoquímica (CD68, HAM-56, CD3, CD20, GFAP, NF) e microscopia eletrônica. Texto sobre histoplasmose.

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Grocott + HE. Na nossa opinião, a técnica de Grocott é a melhor para demonstrar fungos em tecidos, e a melhor contracoloração é HE. Para bons resultados, tanto o Grocott como o HE devem ser 'suaves'. O Grocott deve deixar os fungos em tom marrom tabaco, para permitir visualização dos detalhes das paredes celulares. Para tal, deve-se acompanhar a impregnação ao microscópio, interrompendo com tiossulfato quando se atinge o ponto ótimo, geralmente com cerca de 10 a 15 minutos. Se este for ultrapassado, os fungos ficam em negro carregado, perdendo transparência. O mesmo se diga da HE - deve-se contracorar rapidamente com a hematoxilina, depois com a eosina, para revelar as células e suas relações com os parasitas, sem saturar os tons. Os tempos corretos dependem dos corantes, temperatura ambiente, etc., e devem ser determinados por tentativa e erro.

Grocott + HE, lâmina escaneada.

Em comparação com a foto acima (feita sem Grocott), nota-se que a lesão granulomatosa em cima e à esquerda, está mais escura, devido à riqueza em fungos. A foto seguinte é feita com melhor resolução (1200 dpi ou dots per inch).

Lâmina escaneada (1200 dpi).

As estrias em negro na lesão granulomatosa representam fungos.

Grocott + HE.

Lesão hemorrágica do III ventrículo.

A lesão é constituída por exsudato de neutrófilos e macrófagos. Os corpúsculos escuros são fungos ou aglomerados deles, geralmente em vacúolos nos macrófagos.

Histoplasmas em macrófagos. A grande maioria dos parasitas é observada em macrófagos, uni- ou multinucleados (estes qualificariam como células gigantes). A técnica impregna pela prata a parede celular do fungo, constituída por carboidratos complexos. Os fungos estão livres no citoplasma ou em vacúolos (fagossomos ou fagolisossomos). Os vacúolos podem ser amplos, e conter muitos microrganismos. Alguns aparecem vazios, não ficando claro se os fungos ficaram fora de plano ou degeneraram.





Histoplasmas, morfologia. Os fungos mostram notável regularidade. Aparecem como leveduras pequenas, redondas ou levemente ovaladas, com 2 a 4 mm, formando cachos ou fileiras. É difícil testemunhar uma divisão celular, mas sabe-se da literatura que a reprodução é por brotamento simples nos vacúolos. Para um exemplo em microscopia eletrônica, clique.

Fungos em neutrófilos. No exsudato purulento, o Grocott destaca elegantemente a morfologia dos parasitas e o HE permite localizá-los no citoplasma dos neutrófilos. Pela riqueza em fungos, os neutrófilos (como os macrófagos) são impotentes em destruí-los. Em microscopia eletrônica, é possível observar fungos viáveis e degenerados lado a lado.

Fungos em espaços perivasculares.

Este pequeno vaso está tão comprometido que sua estrutura é difícil de reconhecer. Em sua volta há várias células contendo fungos. Para mais sobre vasculite de pequenos vasos na histoplasmose, clique.

Grocott + verde luz.

Esta outra técnica usa um Grocott carregado, em que os fungos são saturados na impregnação pela prata, tomando cor cinza ou negra (uma hora na estufa a 60°C). A coloração de fundo por verde luz (light green) não permite reconhecer detalhes celulares, nem separar núcleo do citoplasma. Por isso, a localização dos fungos no tecido é menos clara que com HE.

Grocott + verde luz.

Margem da lesão fibrótica - gliótica.

Nesta lesão, já comentada em HE e Masson, há grande riqueza em parasitas, que se destacam no Grocott. No tecido em torno, fungos são escassos ou ausentes.

Grocott + verde luz. Lesão hemorrágica no III ventrículo. Os fungos aparecem principalmente dentro de fagossomos de macrófagos, onde proliferam formando pequenos cachos. Em outras áreas, parecem soltos no tecido, mas provavelmente estão também dentro de células. Por vezes concentram-se em torno de vasos, formando manguitos. Chamam a atenção pela regularidade de forma e diâmetro. Excepcionalmente, observam-se fungos bem maiores, inclusive em brotamento.

Grocott + verde luz. Histoplasmas em neutrófilos. Ver também em Grocott + HE e em microscopia eletrônica.

PAS + hematoxilina. A técnica associa a reação histoquímica do PAS (ácido periódico + reativo de Schiff) com contracoloração por hematoxilina. A parte viva do histoplasma (o protoplasma, núcleo + citoplasma) cora-se em magenta, a parede celular fica em tom mais pálido.

Colorações especiais deste caso pelos técnicos Thainá Milena Stela de Oliveira e Sérgio Roberto Cardoso,
Depto de Anatomia Patológica da FCM-UNICAMP.

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Página de resumo do caso. Texto sobre histoplasmose. Mais imagens deste caso: »»»		RM 26/9/2011	RM 29/3/2012	TC 30/3/2012


Macro	HE, lesões no III ventrículo	HE, lesão gliótica / fibrótica na comissura anterior	HE, nódulo necrótico no corno anterior do ventrículo lateral D.	HE, lesões no IV ventrículo


Tricrômico de Masson, meninges da base	Grocott + HE, Grocott + verde luz, PAS	CD68, HAM-56, CD3, CD20	GFAP, NF	Microscopia eletrônica