Na literatura, as granulações citoplasmáticas das células tumorais granulares são descritas como lisossomos acumulados em grande abundância. Seriam, portanto, análogos a grânulos de lipofuscina, ou pigmento de desgaste, que se forma ao longo de anos em células que não se dividem, como neurônios e miocardiócitos. 

Para estudar a ultraestrutura dos grânulos, é necessária a alta resolução do microscópio eletrônico. Para tal, dispúnhamos de  dois tipos de amostra :

a) Amostra coletada em líquido de Karnovsky durante o ato cirúrgico e processada para microscopia eletrônica como habitual. Esta produz resultados técnicos de alta qualidade, pela ótima preservação das membranas e organelas celulares. Contudo, a área rica em células granulares, documentada em HE, colorações especiais e imunohistoquímica, era exígua, e não foi contemplada na coleta a fresco (que é feita às cegas). 

b) Assim, retiramos um pequeno fragmento do bloco de parafina na região de maior concentração de células granulares. O fragmento foi colhido em xilol, retrocedido para álcool absoluto, álcoois de hidratação crescente até água destilada. Foi daí reprocessado para microscopia eletrônica como habitual, passando por ósmio, uranila, inclusão em resina, cortes grossos corados por azul de toluidina e cortes ultrafinos contrastados por citrato de chumbo.  Os resultados são demonstrados abaixo. 

Em relação ao material colhido a fresco em Karnovsky, o material ex-parafina mostra grande perda da qualidade morfológica, especialmente das membranas celulares e de organelas, como as mitocôndrias.  Estruturas rígidas, como fibras colágenas, filamentos intermediários intracitoplasmáticos, certas organelas, como os lisossomos, e os núcleos, resistem relativamente bem. A vantagem do método de retrocedimento a partir da parafina é que uma área de interesse já comprovada pela microscopia óptica pode ser analisada ultraestruturalmente. A menor qualidade é compensada pela riqueza nos elementos que se deseja estudar. 

Nesta página, o material ex-parafina. Na outra página, microscopia eletrônica da amostra coletada em Karnovsky. 

A presente amostra foi retirada do bloco de parafina na área de substância branca ao lado do cisto tumoral. Continha muitas células granulares e astrócitos gemistocíticos. Aqui, ambos tipos de células são bem representados, em meio a um interstício contendo axônios mielínicos e prolongamentos astrocitários. 

Os núcleos das células granulares  apresentavam-se bem preservados, com cromatina bem distribuída, e condensada abaixo da membrana nuclear. Em algumas, havia indentações e dobras da membrana nuclear. 

Como antecipado pelas colorações especiais (PAS), e imunohistoquímica, as células granulares neoplásicas contêm grande quantidade de lisossomos irregulares e eletrodensos, dispersos em um citoplasma pobre em filamentos intermediários. A pobreza ajuda a explicar a freqüente negatividade para GFAP na IH. 

vs. 

astrócito gemistocítico. 

Ao lado, comparação de imunohistoquímica para GFAP e microscopia eletrônica. O astrócito à esquerda marca fortemente no citoplasma para este filamento intermediário que é visto em microscopia eletrônica como finos filamentos eletrodensos (para maior aumento, clique).  Já a célula granular, embora também de natureza astrocitária, é pobre em GFAP (aparece clara na IH). Na ME, é rica em lisossomos, mas pobre em filamentos citoplasmáticos. 

Os lisossomos das células granulares são já clara- e abundantemente visíveis em HE e tricrômico de Masson. São PAS positivos e marcam em imunohistoquímica para CD68, como os lisossomos de macrófagos. Isto pode induzir confusão das células granulares com macrófagos, pois apesar de terem natureza astrocitária, são pobres em GFAP (acima). 

Em analogia à lipofuscina das células normais fora do ciclo de divisão celular, estes lisossomos de células neoplásicas corresponderiam a acúmulos de um descarte que a célula não consegue eliminar, permanecendo no citoplasma.  Já observamos um ependimoma pigmentado, cujas material intracitoplasmático também deve corresponder a lipofuscina, a julgar pela PAS positividade.

Estas células não neoplásicas reacionais são encontradas na substância branca próxima ao tumor, lado a lado às células granulares, que são neoplásicas.  Têm citoplasma abundante, que em microscopia eletrônica revela grande riqueza em filamentos intermediários do citoesqueleto. Estes são constituídos por GFAP e vimentina, demonstráveis por reações imunohistoquímicas. Clique para detalhes destas. 

Apesar deste material ter sido reprocessado de um bloco de parafina, há uma notável preservação da ultraestrutura.  Os filamentos intermediários do citoesqueleto, devido à sua estrutura rígida, são os melhor conservados. São também visíveis as cisternas do retículo endoplasmático rugoso, com ribossomos aderidos. A membrana celular externa e as mitocôndrias são as que mais sofrem com o processamento em xilol e parafina a quente. 

Na foto ao lado, parte do citoplasma de uma célula granulosa (embaixo) e parte do citoplasma de um astrócito  gemistocítico, em contato. Os núcleos das duas células estão fora do plano de corte. Notar a riqueza em lisossomos na célula granulosa e sua ausência no astrócito, onde há grande abundância de filamentos intermediários. 

Os elementos da substância branca, exceto as células granulares (neoplásicas) e os astrócitos gemistocíticos (reacionais), são os que mais sofrem com a inclusão em parafina. É virtualmente impossível reconhecer os oligodendrócitos. Os axônios mielínicos são ainda discerníveis, sem bem que na maioria com severas distorções.  Como as membranas citoplasmáticas são destruídas, os limites entre células vizinhas são perdidos. 

Axônios mielínicos da substância branca são ainda reconhecíveis através de suas baínhas de mielina, que se destacam como anéis negros. Os axônios estão retraídos, mas em alguns ainda é possível reconhecer neurofilamentos, que são os filamentos intermediários do citoesqueleto do axônio. Microtúbulos não são mais visíveis. Para axônios demonstrados por IH para neurofilamento, clique.