Astrocitoma  de  células  granulares  do  cérebro.
10.  Microscopia  eletrônica  de  material  parafinado.
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Masc. 68 a.  Página de resumo do caso.  Clique para páginas detalhadas sobre : exames de imagem : 2011, 2012;  histologia - HE, colorações especiais (Masson, PAS), imunohistoquímica (GFAP, VIM, nestina, CD34, CD68, HAM-56, S-100, NF, CD99, Ki-67, p53), microscopia eletrônica (Karnovsky, parafina). Comentários: (1) (2). Texto sobre astrocitoma de células granulares. 
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Microscopia eletrônica - duas abordagens : Karnovsky, parafina. 

Na literatura, as granulações citoplasmáticas das células tumorais granulares são descritas como lisossomos acumulados em grande abundância. Seriam, portanto, análogos a grânulos de lipofuscina, ou pigmento de desgaste, que se forma ao longo de anos em células que não se dividem, como neurônios e miocardiócitos. 

Para estudar a ultraestrutura dos grânulos, é necessária a alta resolução do microscópio eletrônico. Para tal, dispúnhamos de  dois tipos de amostra :

a) Amostra coletada em líquido de Karnovsky durante o ato cirúrgico e processada para microscopia eletrônica como habitual. Esta produz resultados técnicos de alta qualidade, pela ótima preservação das membranas e organelas celulares. Contudo, a área rica em células granulares, documentada em HE, colorações especiais e imunohistoquímica, era exígua, e não foi contemplada na coleta a fresco (que é feita às cegas). 

b) Assim, retiramos um pequeno fragmento do bloco de parafina na região de maior concentração de células granulares. O fragmento foi colhido em xilol, retrocedido para álcool absoluto, álcoois de hidratação crescente até água destilada. Foi daí reprocessado para microscopia eletrônica como habitual, passando por ósmio, uranila, inclusão em resina, cortes grossos corados por azul de toluidina e cortes ultrafinos contrastados por citrato de chumbo.  Os resultados são demonstrados abaixo. 

Em relação ao material colhido a fresco em Karnovsky, o material ex-parafina mostra grande perda da qualidade morfológica, especialmente das membranas celulares e de organelas, como as mitocôndrias.  Estruturas rígidas, como fibras colágenas, filamentos intermediários intracitoplasmáticos, certas organelas, como os lisossomos, e os núcleos, resistem relativamente bem. A vantagem do método de retrocedimento a partir da parafina é que uma área de interesse já comprovada pela microscopia óptica pode ser analisada ultraestruturalmente. A menor qualidade é compensada pela riqueza nos elementos que se deseja estudar. 

Nesta página, o material ex-parafina. Na outra página, microscopia eletrônica da amostra coletada em Karnovsky. 

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Destaques  da  microscopia eletrônica. 
Material fixado em Karnovsky
Aspecto geral - células tumorais. Citoplasma rico em lisossomos, núcleo excêntrico, muitas células circundadas for fibras colágenas.  Lisossomos - complexos, grande variedade de forma, tamanho e aspecto morfológico.  Retículo endoplasmático liso e rugoso abundante, por vezes com grande dilatação das cisternas. 
Células poligonais agrupadas. Estas com poucos lisossomos, limites nítidos, em íntimo contato pelas membranas.  Pseudoinclusões intranucleares. Lingüetas de citoplasma em dobras da membrana nuclear.  Mitose.  Placa metafásica típica. 
Material reprocessado pós inclusão em parafina
Células granulares que infiltravam a substância branca. Citoplasma riquíssimo em lisossomos, pobre em filamentos intermediários.  Lisossomos das mais variadas formas povoavam o citoplasma das células granulares Astrócitos gemistocíticos  coexistiam com as células granulares na substância branca. 
Filamentos intermediários. Principal constituinte do citoplasma dos astrócitos gemistocíticos reacionais.  Coexistência de células granulares e astrócitos gemistocíticos em contato Axônios mielínicos  entre as células granulares e astrócitos gemistocíticos na substância branca
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MATERIAL  DESPARAFINADO E REPROCESSADO
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Aspecto geral. 

A presente amostra foi retirada do bloco de parafina na área de substância branca ao lado do cisto tumoral. Continha muitas células granulares e astrócitos gemistocíticos. Aqui, ambos tipos de células são bem representados, em meio a um interstício contendo axônios mielínicos e prolongamentos astrocitários. 

Os núcleos das células granulares  apresentavam-se bem preservados, com cromatina bem distribuída, e condensada abaixo da membrana nuclear. Em algumas, havia indentações e dobras da membrana nuclear. 

Nucléolos.   Alguns astrócitos gemistocíticos mostram nucléolos. O encontro de nucléolos sugere alta atividade de síntese proteica, pois é no nucléolo que os ribossomos são sintetizados. No caso, o astrócito (não neoplásico), está sintetizando abundante quantidade de filamentos intermediários, elementos do citoesqueleto, que contêm GFAP e VIM. Esta atividade resulta em hipertrofia da célula, reacional às células neoplásicas (granulares) nas proximidades. 
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Células granulares. 

Como antecipado pelas colorações especiais (PAS), e imunohistoquímica, as células granulares neoplásicas contêm grande quantidade de lisossomos irregulares e eletrodensos, dispersos em um citoplasma pobre em filamentos intermediários. A pobreza ajuda a explicar a freqüente negatividade para GFAP na IH. 

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Célula granular 

vs. 

astrócito gemistocítico. 

Ao lado, comparação de imunohistoquímica para GFAP e microscopia eletrônica. O astrócito à esquerda marca fortemente no citoplasma para este filamento intermediário que é visto em microscopia eletrônica como finos filamentos eletrodensos (para maior aumento, clique).  Já a célula granular, embora também de natureza astrocitária, é pobre em GFAP (aparece clara na IH). Na ME, é rica em lisossomos, mas pobre em filamentos citoplasmáticos. 

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Lisossomos.  Lisossomos são as organelas citoplasmáticas encarregadas da digestão de partículas fagocitadas e de moléculas e estruturas  senescentes da célula, incluindo organelas como as mitocôndrias. Normalmente são eletrodensos, arredondados, pequenos e limitados por membrana única.  Os aqui observados apresentam forma e tamanho variáveis, multilobulados, não raro confluentes. Corresponderiam aos grânulos de lipofuscina de células normais que não se dividem. 
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Células granulares são astrócitos neoplásicos ricos em lisossomos. O motivo para estas células neoplásicas conterem tal abundância de lisossomos nos escapa. Poderia decorrer da superprodução de membranas ou organelas anômalas, ou de uma dificuldade intrínseca da célula de digerir esses elementos, talvez pela falta de uma ou mais enzimas lisossomais.  As proteínas e lípides destas membranas celulares parcialmente digeridas podem sofrer polimerização e constituir grandes massas de macromoléculas. Novos fragmentos de organelas senescentes, como mitocôndrias e retículo endoplasmático liso ou rugoso, vão sendo incorporadas aos grânulos existentes, o que ajudaria a explicar a heterogeneidade dos grânulos, e sua forma irregular, com lobulações, saliências e reentrâncias. 
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Lisossomos em microscopia óptica.

Os lisossomos das células granulares são já clara- e abundantemente visíveis em HE e tricrômico de Masson. São PAS positivos e marcam em imunohistoquímica para CD68, como os lisossomos de macrófagos. Isto pode induzir confusão das células granulares com macrófagos, pois apesar de terem natureza astrocitária, são pobres em GFAP (acima). 

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'Lixo intracelular'. 

Em analogia à lipofuscina das células normais fora do ciclo de divisão celular, estes lisossomos de células neoplásicas corresponderiam a acúmulos de um descarte que a célula não consegue eliminar, permanecendo no citoplasma.  Já observamos um ependimoma pigmentado, cujas material intracitoplasmático também deve corresponder a lipofuscina, a julgar pela PAS positividade.

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Astrócitos gemistocíticos 
(não neoplásicos).

Estas células não neoplásicas reacionais são encontradas na substância branca próxima ao tumor, lado a lado às células granulares, que são neoplásicas.  Têm citoplasma abundante, que em microscopia eletrônica revela grande riqueza em filamentos intermediários do citoesqueleto. Estes são constituídos por GFAP e vimentina, demonstráveis por reações imunohistoquímicas. Clique para detalhes destas. 

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Citoplasma de um astrócito gemistocítico. 

Apesar deste material ter sido reprocessado de um bloco de parafina, há uma notável preservação da ultraestrutura.  Os filamentos intermediários do citoesqueleto, devido à sua estrutura rígida, são os melhor conservados. São também visíveis as cisternas do retículo endoplasmático rugoso, com ribossomos aderidos. A membrana celular externa e as mitocôndrias são as que mais sofrem com o processamento em xilol e parafina a quente. 

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Célula  granulosa e prolongamento astrocitário lado a lado. 

Na foto ao lado, parte do citoplasma de uma célula granulosa (embaixo) e parte do citoplasma de um astrócito  gemistocítico, em contato. Os núcleos das duas células estão fora do plano de corte. Notar a riqueza em lisossomos na célula granulosa e sua ausência no astrócito, onde há grande abundância de filamentos intermediários. 

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Interstício da substância branca, axônios. 

Os elementos da substância branca, exceto as células granulares (neoplásicas) e os astrócitos gemistocíticos (reacionais), são os que mais sofrem com a inclusão em parafina. É virtualmente impossível reconhecer os oligodendrócitos. Os axônios mielínicos são ainda discerníveis, sem bem que na maioria com severas distorções.  Como as membranas citoplasmáticas são destruídas, os limites entre células vizinhas são perdidos. 

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Axônios  mielínicos. 

Axônios mielínicos da substância branca são ainda reconhecíveis através de suas baínhas de mielina, que se destacam como anéis negros. Os axônios estão retraídos, mas em alguns ainda é possível reconhecer neurofilamentos, que são os filamentos intermediários do citoesqueleto do axônio. Microtúbulos não são mais visíveis. Para axônios demonstrados por IH para neurofilamento, clique.

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Preparações de microscopia eletrônica pelas técnicas, Sras. Marilúcia Ruggiero Martins e Geralda Domiciana de Pádua. A elas, nossos agradecimentos. 
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Página de resumo do casotexto, mais imagens.
TC, RMs 2011 RM após 1 ano HE Colorações especiais : 
Masson, PAS
Imunohistoquímica para GFAP VIM, nestina  CD34  CD68, HAM-56
S-100, NF, CD99 Ki-67, p53 Microscopia eletrônica, 
material fixado em Karnovsky
ME, material reprocessado de bloco de parafina
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Astrocitoma de células  granulares : Neuroimagem Neuropatologia Texto
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