Esta amostra para microscopia eletrônica foi retirada do material de reserva em formol cerca de um mês após a recepção do caso. Mesmo assim, há preservação aceitável da ultraestrutura de células do hospedeiro e de alguns parasitas. Outros apresentavam morfologia sugestiva de degeneração, que pode decorrer das condições dentro do criptococoma e de ação das células do hospedeiro. 

Foram examinados dois blocos. No primeiro, tirado da parte periférica da lesão, os fungos apareciam livres. No segundo, em área profunda, muitos estavam fagocitados por macrófagos. 

Fungos livres viáveis. 

Nestes, reconhecem-se organelas, em especial mitocôndrias, provável material nuclear, vesículas e vacúolos, possivelmente de lípides.   Ocasionalmente, a membrana plasmática pode ser discernida em contato com a superfície interna da parede celular. 

A parede celular é eletrodensa, formada por camadas compactas, um pouco mais frouxas na periferia. 

Continua-se com a espessa cápsula polissacarídica, de finíssimas fibrilas em disposição radial. Estas estão inseridas na parede celular e se rarefazem gradualmente à medida que se afastam da célula. 

A contrastação dos fungos por tinta nanquim (ou tinta da China) demonstra a espessura da cápsula polissacarídica, muitas vezes maior que a da parede celular, que é mais densa e refringente. 

Em HE, a parte viva do fungo fica homogênea e basófila, sem distinção de núcleo ou citoplasma. A parede celular e a cápsula não se coram. 

Das técnicas de coloração especial, o PAS cora a  parede celular mais forte- e a cápsula mais fracamente. Grocott cora apenas a parede celular em negro, ficando a cápsula incolor. Em outra página, ver também resultados com mucicarmim, Giemsa e Papanicolaou. 

A camada eletrodensa que circunda a célula fúngica é composta por diversos tipos de açúcares, incluindo a quitina, beta 1,3 glucan,  beta 1,6 glucan, e manoproteínas. 

A quitina é um polímero de longa cadeia de N-acetilglicosamina, um derivado da glicose que contém nitrogênio. Participa da parede celular de fungos, do exoesqueleto de artrópodes como crustáceos (caranguejos, lagostas, camarões) e insetos.  Em termos de estrutura, a quitina pode ser comparada à celulose, e em termos de função, à proteína queratina.  Fisicamente, quitina é translúcida, flexível e muito resistente.  Na parede celular de fungos, a quitina é encontrada na camada mais próxima à membrana plasmática (portanto, mais interna). 

Beta glucans são polissacarídeos que contêm apenas glicose como componente estrutural, sendo as moléculas unidas por ligações beta glicosídicas.  Correspondem à maior parte da parede celular dos fungos, estando situados na parte média da mesma. 

Manoproteínas são proteínas altamente glicosiladas pelo monossacarídeo manose.  Ocorrem na parte mais externa da parede celular ou, segundo outras fontes, também na face interna, junto com a quitina.

Como todos os componentes químicos da parede celular são açúcares, compreende-se a forte PAS positividade da mesma. 

Figura redesenhada a mão livre e adaptada. 

Esta estrutura é fundamental na estratégia do criptococo contra as defesas do hospedeiro. Em microscopia eletrônica, aparece como finas fibrilas em arranjo radial inseridas na superfície externa da parede celular. Tem-se a impressão de que são finamente ramificadas, sendo que a densidade dos filamentos aumenta do centro para a periferia. A espessura da cápsula é geralmente pelo menos equivalente ao diâmetro da célula fúngica. O caráter fibrilar e frouxo da cápsula é também demonstrável por mucicarmim e permite compreender a penetração de partículas de tinta nanquim (carbono coloidal) que observamos quando o formol da reserva de material, que tinha textura viscosa e era riquíssimo em fungos, foi misturado com uma gota da tinta.  A penetração de partículas de tinta nanquim na cápsula foi observada por Zaragoza et al. (2006) em dois padrões, sendo um de anel na parte média da cápsula, outro de concentração em polos opostos da cápsula. Neste caso (que observamos no nosso material), os polos marcados ficavam em orientação perpendicular ao plano de emergência de brotos.

Dados da literatura sugerem que os mucopolissacárides da cápsula são polímeros de cadeia ramificada (Cordero et al. 2011). Há também evidência de que o grau de ramificação dos polímeros influencia na capacidade da cápsula de interferir com a fagocitose mediada por complemento, inibir a produção de óxido nítrico por células macrofágicas, proteger contra radicais livres do oxigênio, entre outros efeitos, tendo, portanto, importância na virulência do parasita. 

Os componentes principais da cápsula polissacarídica são glucuronoxilomanan, galactoxilomanan e manoproteínas.  Considera-se que glucuronoxilomanan é sintetizado no compartimento intracelular e secretado por exocitose (Yoneda e Doering, 2006).

Referências. 

• Cordero RJ, et al. Evidence for branching in cryptococcal capsular polysaccharides and consequences on its biological activity. Mol Microbiol. 2011 Feb;79(4):1101-17. 
• Jesus MD, et al. Glucuronoxylomannan, galactoxylomannan, and mannoprotein occupy spatially separate and discrete regions in the capsule of Cryptococcus neoformans. Virulence. 2010 Nov-Dec;1(6):500-8. 
• Kumar P, et al. Emerging themes in cryptococcal capsule synthesis. Curr Opin Struct Biol. 2011 Oct;21(5):597-602.
• Reese AJ, et al. Loss of cell wall alpha (1-3) glucan affects Cryptococcus neoformans from ultrastructure to virulence. Mol Microbiol. 2007 Mar;63(5):1385-98.
• Yoneda A, Doering TL. A eukaryotic capsular polysaccharide is synthesized intracellularly and secreted via exocytosis. Mol Biol Cell. 2006 Dec;17(12):5131-40. 
• Zaragoza O, et al. Equatorial ring-like channels in the Cryptococcus neoformans polysaccharide capsule.  FEMS Yeast Res. 2006 Jun;6(4):662-6.

Mitocôndrias  são identificáveis pelas suas cristas, indicando que a célula estava viva quando da fixação. O citoplasma é eletrodenso e granuloso, os grânulos podendo corresponder a ribossomos ou glicogênio. A retração da parede celular que se destacou da cápsula deve-se  provavelmente a artefato de processamento. 

Esta célula fúngica aparece com citoplasma eletrodenso, grumoso, onde não é possível distinguir estruturas vitais.  Aparentemente houve desidratação da célula e condensação de seu protoplasma, levando ao colapso e formato em cuia.  A cápsula  polissacarídica está rarefeita, que tomamos como outra evidência de degeneração celular. 

Este outro fungo parece ter duas paredes concêntricas, mas provavelmente se trata de um parasita colapsado em cuia que foi cortado em plano tangencial.  Também aqui a cápsula está rarefeita com poucas fibrilas, vistas tanto na superfície externa como na parte central, devido ao plano de corte. 

Mostram citoplasma amplo em relação ao núcleo,  rarefeito, com abundantes vacúolos, possivelmente derivados de fagossomos ou fagolisossomos.  Há também várias mitocôndrias pequenas e pobres em cristas. Praticamente não se observa retículo endoplasmático rugoso ou ribossomos livres. 

Caracterizam-se pelo núcleo com nucléolo proeminente e cromatina 'em roda de carroça' (isto é, em grumos na periferia).  O nucléolo é a organela onde são organizados os ribossomos, abundantes nos plasmócitos. O plasmócito da foto parece ser binucleado. 

O citoplasma denso é riquíssimo em retículo endoplasmático rugoso, disposto em cisternas paralelas lembrando arquibancadas.  As membranas do RER são crivadas de ribossomos engajados na síntese de imunoglobulinas.

Estes também têm citoplasma muito rico em ribossomos e retículo endoplasmático rugoso, devido à ativa síntese de colágeno, mas que não atinge a densidade vista nos plasmócitos.